Các phương pháp nhận diện bệnh cúm?

Trong hai bài viết trước chúng ta đã cùng nhau tìm hiểu về “cấu tạo của virus cúm gia cầm” và “các chủng gây bệnh trên thế giới hiện nay” cũng như những thiệt hại mà chúng gây ra. Trong bài viết lần này, chúng tôi sẽ cùng các bạn tìm hiểu thêm về các phương pháp nhận diện bệnh cúm gia cầm để từ đó kịp thời đưa ra những biện pháp tiêu hủy, khống chế mầm bệnh lây lan cũng như giảm tối đa những thiệt hại không đáng có mà dịch bệnh nguy hiểm này mang lại.

Cũng giống như các bệnh thông thường khác, luôn có hai phương pháp giúp nhận diện 1 bệnh là dựa vào các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích lúc mổ khám (gọi chung là nhận diện lâm sàng) và phương pháp thứ hai là nhận diện dựa vào các phản ứng đặc trưng trong phòng thí nghiệm (nhận diện trong phòng thí nghiệm). Khi nghi ngờ có dịch xuất hiện, ta lần lượt nhận diện bằng hai phương pháp trên.

 

 

Phương pháp nhận diện lâm sàng:

Các loài cảm nhiễm với virus cúm gia cầm:
Tất cả các loại gia cầm như gà, gà tây, vịt, ngan, ngỗng, chim cút, đà điểu, chim cảnh, chim hoang dã đều mẫn cảm với bệnh.
Virus cúm còn gây bệnh đường hô hấp ở chồn, hải cẩu, cá voi, người.

Ngoài ra người ta còn phân lập được virus từ lợn (H1N1 và H1N2), chồn, chuột, thỏ.

 

Các loài cảm nhiễm cúm và vòng truyền lây (Ảnh sưu tầm)

 

Nhận diện lâm sàng qua triệu chứng bệnh

Triệu chứng bệnh phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố : độc lực virus, tuổi gia cầm bệnh, tính biệt, môi trường (mật độ, nhịêt độ, ánh sáng, thành phần không khí…), chế độ dinh dưỡng, sự bội nhiễm các vi khuẩn, virus khác…
Trên chim hoang và vịt nhà ít có triệu chứng lâm sàng.

 

Gà bị bệnh chết rất nhanh (Ảnh sưu tầm)

Trên gia cầm (gà, gà tây): Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết rất cao. Thời gian ủ bệnh từ vài giờ đến 21 ngày, có trường hợp kéo dài đến 28 ngày. Gia cầm bệnh sốt cao; chảy nước mắt; đứng tụm một chỗ; lông xù; phù đầu và mắt; mồng, mào, yếm tím bầm; da tím tái; chân xuất huyết; chảy nước dãi ở mỏ. 

 

 Gà bị cúm mào tím bầm; mắt sung huyết (Ảnh: ĐH cornell)

 

Gà bị cúm mào tím bầm, sưng; mắt sung huyết (Ảnh: ĐH Cornell)

Con vật khi sốt cao có biểu hiện không bình thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh. Triệu chứng chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn, gầy yếu, giảm trứng. Trường hợp nặng có biểu hiện ho, khó thở, suy sụp hô hấp; rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở tư thế không bình thường. Những triệu trứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc riêng rẽ.

 

Gà chết do cúm gia cầm (Ảnh sưu tầm)

 

Tụ huyết, xuất huyết ở da chân-biểu hiện đặc trưng của bệnh cúm gia cầm (Ảnh sưu tầm)

Đối với người, sau khi nhiễm, thời gian ủ bệnh từ 1 đến 5 ngày trung bình là khoảng 3 ngày. Lúc đầu bệnh nhân sốt cao 39°c và kéo dài từ 1 đến 3 ngày, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, toàn thân ê ẩm, ho, sổ mũi nhức đầu khủng khiếp, có thể tiến tới khó thở rồi nghẹt thở, kèm theo các rối loạn về thính giác và thị giác. Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 gây tỉ lệ tử vong rất cao cả ở gia cầm và trên người, có người có thể nhiễm cả đường hô hấp trên và dưới. Trong trường hợp không xảy ra những biến chứng phức tạp, sự gây nhiễm tự giới hạn và bệnh nhân tự phục hồi trong vòng một tuần. Tuy nhiên, nếu trường hợp diễn biến phức tạp, bệnh có thể trở nên trầm trọng thậm chí có thể dẫn đến tử vong, đó là trường hợp bị biến chứng đi kèm viêm phổi do virus hoặc do vi khuẩn hoặc cả hai.

 

Cúm trên người (Ảnh sưu tầm)

Như vậy, khi nghi ngờ có sự xuất hiện của cúm, việc đầu tiên là ta phải quan sát tổng thể tất cả những biểu hiện bên ngoài của toàn đàn căn cứ vào các triệu chứng chính như trên. Ví dụ, đầu tiên ta quan sát xem gà có sốt không? Có xuất huyết, tụ huyết ở đâu không? Có triệu chứng thần kinh không? Có khó thở không? Tỷ lệ chết và tốc độ lây bệnh của toàn đàn như thế nào?...Từ đó có thể đưa ra những chẩn đoán sơ bộ ban đầu >> xem nghi ngờ bệnh gì nhất >>căn cứ vào đó mà có hướng quan sát bệnh tích khi mổ khám (nghĩa là khi mổ khám, ta sẽ tập trung quan sát kỹ những cơ quan có bệnh tích đặc trưng đối với bệnh mà ta nghi ngờ).

 

Nhận diện lâm sàng qua  bệnh tích mổ khám:

 

 Cơ chế xâm nhập và gây bệnh của virus cúm

 

Virus xâm nhập vào trong cơ thể thông thường đi qua miệng trước tiên nhưng không lưu cữu tại miệng mà đi tiếp vào phía trong của đường hô hấp và đi lên kết mạc mắt. Virus thường ở lại đây trong 3-5 ngày và gây ra các bệnh tích đặc trưng như xung huyết ở mí mắt; khí quản viêm, có dịch nhầy, xuất huyết tràn lan; sau đó, nó xâm nhập và gây xuất huyết gần như khắp cơ quan nội tạng trong cơ thể. Ví dụ như, xuất huyết ở cơ ngực, cơ đùi, đường ruột, dưới da, mào, tích…Sau đây là một số hình ảnh bệnh tích đặc trưng của bệnh cúm trên gia cầm mà chúng tôi tổng hợp được.

 

Khí quản xuất huyết tràn lan cả trong và ngoài lòng ống (Ảnh: ĐH Cornell)

 

Xuất huyết toàn bộ đường ruột (Ảnh: ĐH Cornell)

 

Xuất huyết tràn lan dưới da chân (Trái, ảnh: ĐH Cornell) và chân gà bình thường(phải).

 

Mào mặt tích nước, xuất huyết (Ảnh: ĐH Cornell)

 

Cơ ngực xuất huyết, tích nước dưới da (Ảnh: ĐH Cornell)

 

Cơ ngực xuất huyết, tích nước dưới da (Ảnh: ĐH Cornell)

 

Xuất huyết nặng ở lớp mỡ vùng bụng (Ảnh sưu tầm)

Như vậy, Sau khi Kiểm tra tổng thể toàn bộ bệnh tích mổ khám, kết hợp với các triệu chứng điển hình như trên thì về cơ bản ta đã có thể kết luận được căn nguyên gây bệnh (gần 90% là chính xác nếu con vật xuất hiện đầy đủ những triệu chứng, bệnh tích đặc trưng như trên). Tuy nhiên, để có thể khẳng định chính xác hơn đây là bệnh do virus cúm gia cầm gây ra thì ta cần phân biệt được với một số bệnh tương tự khác như Newcastle, tụ huyết trùng cấp và gumboro. Đồng thời tiến hành các phản ứng phân tích đặc trưng với cúm trong phòng thí nghiệm.

Chẩn đoán phân biệt cúm gia cầm với 1 số bệnh khác:

 

 

Dạ dày tuyến của gà bình thường(trái) và gà bị Gum(phải)

 

 Dạ dày tuyến của gà bình Newcastle(trái) và gà bị cúm(phải)

 

Nhìn chung các bệnh trên có triệu chứng gần giống nhau, bảng trên chỉ là một số triệu chứng có thể dùng để giúp chẩn đoán loại trừ, từ đó có thể cho ta kết quả chẩn đoán nghi ngờ là bệnh gì. Để chính xác, ta cần phải có một số xét nghiệm dưới đây. 

 

Nhận diện trong phòng thí nghiệm:

Sau khi tiến hành đầy đủ các biện pháp chẩn đoán lâm sàng, để khẳng định chính xác nguyên nhân gây bệnh là gì? Thuộc chủng, type nào?...ta nên tiến hành các phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm. Nhất là đối với những bệnh nguy hiểm như cúm thì khi có dấu hiệu nghi ngờ là ta phải lấy mẫu và xét nghiệm ngay, tránh tình trạng chậm trễ gây ra những thiệt hại đáng tiếc.

Hiện nay trên thế giới đang áp dụng một số phương pháp xác định virus cúm trong phòng thí nghiệm như sau:

- Phương pháp nuôi cấy và phân lập virus trong phòng thí nghiệm.
- Phương pháp giải trình tự Nucleotide.
- Phương pháp giải mã ngược (RT_PCR).
- Phương pháp HA-HI.
- Dùng test chẩn đoán nhanh đặc hiệu cho cúm…

Mặc dù hầu hết các phương pháp xác định virus cúm trong phòng thí nghiệm đều đòi hỏi kỹ thuật cao, thiết bị hiện đại và chi phí khá lớn nhưng hầu như tất cả các quốc gia trên thế giới đều không ngại đầu tư cho việc này vì những thiệt hại của cúm gia cầm gây ra.

Dù có nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau nhưng trên thực tế, chỉ có 1 số phương pháp có độ chính xác cao và được dùng khá phổ biến tại tất cả các phòng thí nghiệm chẩn đoán cúm trên thế giới. Thông thường, khi 1 trong số các phương pháp phổ biến này có kết quả xét nghiệm dương tính thì người ta sẽ tiến hành khẳng định và công bố dịch. Dưới đây là nguyên lý của một số phương pháp phổ biến mà chúng tôi chia sẻ để các bạn tham khảo thêm:

 

 

Phương pháp nuôi cấy và phân lập virus trong phòng thí nghiệm:

Virus là loại ký sinh tuyệt đối trong tế bào, chúng không chứa những men cần thiết cho sự trao đổi chất, mà phải hoàn toàn dựa vào hệ thống men và nguồn năng lượng của tế bào chủ. Cho nên virus khác với vi khuẩn là không thể nuôi cấy trong những môi trường nhân tạo được. Xuất phát từ những đặc điểm đó mà người ta chỉ có thể nuôi cấy virus trên cơ thể động vật cảm nhiễm, trên phôi gà hay trên tổ chức mô học.

Cấy mẫu bệnh phẩm nghi có chứa virus cúm lên cơ thể động vật thí nghiệm, lên phôi gà hay lên tổ chức mô >>sau đó tiến hành quan sát các biểu hiện triệu chứng bệnh, các tổn thương bệnh lý đặc trưng bên trong >> xem có phải là những biểu hiện đặc trưng của cúm không. Sau đó, phân lập virus từ tổ chức vừa nuôi cấy >> quan sát dưới kính hiển vi điện tử >> xem hình thái, cấu tạo của virus >> kết hợp tất cả các yếu tố trên >> kết luận xem đó có phải là virus cúm hay không.

 

Ảnh nguyên lý của phương pháp nuôi cấy và phân lập virus

 

 

Phương pháp giải trình tự Nucleotide.

AND (hay ARN) là cơ sở hóa học của gen. Phân tử AND (ARN) là 1 chuỗi xoắn kép (đơn) của hai (một) mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng là A (adenine), C (cytosine), G (guanine), T (thymine). Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau theo 1 thứ tự xác định. Ngoài ra, mỗi loài, chủng sinh vật, vi sinh vật đều có những đoạn gen đặc hiệu mà chỉ chúng mới có.

Giải trình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide này trên phân tử ARN của virus (virus được phân lập từ mẫu bệnh phẩm) từ đó xác định xem phân tử ARN của virus này có đoạn gen đặc hiệu (là 1 đoạn các nucleotide có trật tự sắp xếp đặc thù nhất định) của virus cúm gia cầm hay không. Từ đó đưa ra kết luận mẫu bệnh phẩm có chứa virus cúm gia cầm hay không.

Phương pháp PCR ngược (RT_PCR).

Để hiểu được nguyên lý của phương pháp RT_PCR thì trước tiên ta phải hiểu được nguyên lý của phương pháp PCR.
* Nguyên lý của phương pháp PCR là tạo lượng lớn các đoạn ADN đặc thù từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của ADN-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:

- Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide.
- Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Là tín hiệu chỉ hướng đi (5’ → 3’) của enzyme DNA-polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung.
- Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
- Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và DNase.
- Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq)

Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl. Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhậy và nhanh.

Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là sao chép RNA khuôn thành DNA sợi đôi nhờ hoạt động của enzyme sao chép ngược. Giai đoạn này được thực hiện ở 50÷55°C và thời gian là 30 phút. Giai đoạn 2 là dùng chính DNA vừa sao chép làm khuôn cho phản ứng PCR.

Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm của phản ứng PCR ngược được giảm xuống 4°C để bảo quản cho tới khi sử dụng. Để đánh giá và phát hiện sản phẩm PCR ngược người ta cũng điện di trên gel agarose 0,8÷1%. Và DNA chuẩn là DNA λ được cắt bởi enzyme HindIII có độ dài 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb.

Nói tóm lại, mục đích của phương pháp RT_PCR chính là dùng ARN của virus trong mẫu bệnh phẩm >> sao chép thành AND sợi đôi, sau đó nhân bản đoạn AND đó lên thành nhiều bản giống nhau bằng phương pháp PCR >>tìm kiếm đoạn gen đặc hiệu của virus cúm >>nếu có thì khẳng định trong mẫu bệnh phẩm có chứa virus hay đàn gia cầm dương tính với virus cúm. Nếu không thì ngược lại, đàn gia cầm không chứa virus cúm.

Tóm lại, nhận diện cúm là một trong những khâu quan trọng quyết định thành công hay thấy bại của toàn bộ quá trình kiểm soát cúm về sau. Và nhận diện cúm chỉ có nhiều ý nghĩa khi được xác định 1 cách chính xác, nhanh chóng, kịp thời.

Muốn vậy, ta phải nắm được các phương pháp cũng như những nguyên lý của quá trình nhận diện cúm từ khi nghi ngờ cho đến lúc nhận kết quả từ phòng thí nghiệm thì mới có thể chủ động được khixảy ra dịch bệnh.

 

 

VietDVM team